아니오와 아니요의 차이는 무엇인가요?

한 문장으로 정리해 드리겠습니다.
'응/아니'의 대답을 존대어로 표현할 때는 '아니요'를 쓰고,
문장을 끝맺을 때는 '아니오'를 쓰면 됩니다.

이제 구체적인 설명을 드리겠습니다.

'아니오'는 어떤 사실을 부정하는 뜻을 나타내는 '아니다'의 활용형으로
아래 (1)과 같이 한 문장의 서술어로만 쓰입니다.
'-오'는 동사, 형용사의 어간 뒤나 선어말 어미 뒤에 붙는 어미이며
따라서 이때에는 '-오'가 없으면 온전한 문장이 되지 않습니다.

(1)
ㄱ. 철수가 산에 가오.
ㄴ. 어서 오시오.
ㄷ. 그것은 내 잘못이 아니오.

위에서 '-오'를 빼고 보면
'철수가 산에 가-'나 '어서 오시-'처럼 온전한 문장이 되지를 않습니다.

반면에 
'아니요'는
아래 (2)의 예처럼 '예/네'와 상대되는 말로 쓰이는 감탄사입니다.
(2) ㄱ. 다음 물음에 '예', '아니요'로 답하시오.
(3)
ㄱ. 심부름 갔다 왔니?
ㄴ. 아니요(아뇨), 아직 못 갔다 왔습니다.

즉 '아니요'는 윗사람이 묻는 말에 부정하여 대답할 때 쓰는 말인데
이때 '아니요'는 '아뇨'로 줄여서 쓸 수 있습니다.
 
만일 아랫사람이나 대등한 위치에 있는 사람이 묻는 말에 부정하여 대답할 때는
'아니'를 씁니다. 이 경우엔 '응'이 '아니'와 상대되는 말이 됩니다.

따라서 정리를 하면,
'아니오'는 어떤 사실을 부정하는 뜻을 나타내는 형용사 '아니다'의 활용형이며,
'아니요'는 '예/네'와 상대되는 말로서 윗사람이 묻는 말에 부정하여 말할 때 쓰는 말입니다.